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全基因组测序在耐药结核病监测中的应用

Mcnerney R , Zignol M , Clark T G . Use of whole genome sequencing in surveillance of drug resistant tuberculosis[J]. Expert Review of Anti-infective Therapy, 2018, 16(5).

  • 耐药结核病是对全球公共卫生的威胁。
  • 目前用于监测表型药物敏感性测试(DST)的方法周期长、成本高、技术上具有挑战性,并且需要具有高水平微生物安全性的专门实验室,同时测试的药物数量有限。
  • 全基因组测序(WGS)有可能在单一检测中分析所有抗结核药物的耐药性。
  • 全基因组测序为DST提供了一种更快、更安全的替代方法,并且正在某些地区中用于诊断。
  • 全球监测计划要克服的技术挑战包括:缺乏用于提取样品的标准化方法,对结核病耐药性的不完全理解以及缺乏商定的质量标准。
  • 在未来五年内,WGS可能会用于耐药结核病的监测。但是,在目前尚不具备WGS实验能力的高负担国家中,将需要进行宣传和培训。
简介:

结核病耐药性的威胁已引起全球关注。目前耐药性的监测依赖于表型测试,即在药物的临界浓度下培养细菌。然而在结核病流行国家,这种检测的能力很低。耐药性是由结核分枝杆菌基因组中的突变引起的,所以检测这些突变的全基因组测序技术(WGS)提供了另一种评估耐药性的方法。

研究范围:

本文讨论了结核病耐药性评估的挑战。本文对阐明结核分枝杆菌抗药性的研究进展以及用于检测耐药性的全基因组测序的准确性进行了综述。

专家评论:

将WGS用于结核病耐药性监测具有相当大的优势。WGS对一线药物耐药性检测的准确性很高,但由于我们对耐药相关突变的认识不全面,目前WGS对二线药物的准确性较低。随着测序技术的进步,更安全、更具成本效益的方法将有机会代替表型药物敏感性测试,这仅仅是时间问题。当前的瓶颈是样本的提取优化以允许直接从痰液进行全基因组测序,并且在某些结核病流行国家的生物信息学专业配套有所缺乏。

关键词:结核病;调查;耐药性;传播;全基因组测序

1. 背景


由结核分枝杆菌复合群引起的结核病(TB)持续对全球健康产生深远影响。2016年,估计有1,040万例新发病例和167万例死亡,结核病成为单一传染源致死的首要疾病。最大的负担由中低收入国家承担,同时流行情况不利于其经济增长和发展。目前尚不清楚这种疾病的全部财政影响,但在2015年之前的15年中,与结核相关的死亡估计使世界经济减少了6,160亿美元,其中有12个国家的损失超过了其国内生产总值的1%。近年来的控制疾病取得了一些成功,死亡率有所下降,但世界卫生组织(WHO)在其2017年《全球结核病报告》中指出,当前的进展速度不足以实现2030年的发展目标。特别是,病例的发现和预警率仍然低得令人失望,每年未发现的病例约有410万

需要克服的主要挑战之一是抗结核药物的耐药性。标准的四药联合治疗方案不可能治愈对利福平和异烟肼都具有耐药性的多药耐药结核病(MDR-TB),因为其需要替代的二线药物。耐多药结核病约占接受不到1个月治疗的新结核病病例的4.1%。据估计,在2016年约有19%的已接受治疗的结核病例具有利福平耐药性或耐多药结核病。结核病对其他药物的耐药性也并不少见,已经有123个国家/地区报告了同时也对氟喹诺酮类药物及二线注射药物(SLID)耐药的泛耐药病例(XDR-TB)。来自91个国家和五个地区的估算表明,MDR-TB中的XDR-TB平均比例为6.2%(95%CI:3.6-9.5)

全球结核病治愈率仅为83%,由于耐药性而导致治愈率大大降低。已知患有耐多药结核病患者的治疗成功率仅为54%,而接受XDR-TB治疗患者的成功率仅为30%(2014年数据)。表1总结了推荐用于治疗结核病的药物。世卫组织建议,耐药性疾病的治疗方案应包括5种有效药物。但是,由于对现有药物的广泛耐药性或患者对药物的不耐受性,有时无法提供有效的五种药物治疗方案。

表1 世卫组织推荐的治疗结核病的药物

推荐用于药物敏感性结核病的药物
一线基本药物 异烟肼Isoniazid
利福平Rifampicin
乙胺丁醇Ethambutol
吡嗪酰胺Pyrazinamide
推荐用于利福平耐药和耐多药结核病的药物
氟喹诺酮类Fluoroquinolones 左旋氧氟沙星Levofloxacin
莫西沙星Moxifloxacin
加替沙星Gatifloxacin
二线注射类药物 阿米卡星Amikacin
卷曲霉素Capreomycin
卡那霉素Kanamycin
链霉素Streptomycin*
其他核心二线药物 乙硫异烟胺/丙硫异烟胺Ethionamide/prothionamide
环丝氨酸/特立齐酮Cycloserine/terizidone
利奈唑胺Linezolid
氯法齐明Clofazimine
附加药物(不属于耐多药结核病核心方案的一部分) 吡嗪酰胺Pyrazinamide
乙胺丁醇Ethambutol
高剂量异烟肼High-dose isoniazid
贝达喹啉Bedaquiline
迪拉马尼Delamanid
对氨基水杨酸p-aminosalicylic acid
亚胺培南和西司他丁Imipenem and cilastatin
美罗培南Meropenem
阿莫西林和克拉维酸盐Amoxicillin and clavulanate
氨硫脲Thioacetazone#

* 不是首选药物,未包括在XDR-TB的定义中;# 不推荐用于HIV阳性人群

获得有效治疗是前提需要了解结核的耐药性。在欧洲和北美等较富裕的国家,药敏试验可能是常规护理的一部分,但在许多结核病负担高的国家中,大多数患者并不容易进行此类试验。通过引入Xpert®MTB/RIF(Cepheid Inc,美国)作为一线诊断测试,提高了对利福平耐药性的检测。2016年,对33%的新结核病患者和60%先前治疗过的结核病患者进行了测试,并且有129,689名患者开始接受二线结核病治疗,占估计的利福平耐药病例的22%。对其他抗结核药的耐药性测试较少。结核病是一种空气传播的疾病,未能及时发现和治疗耐药性病例会严重危害公共卫生。关于医院和社区爆发的耐多药结核、广泛耐药结核和更严重的耐药结核病传播的报道,增加了人们回到抗生素前时代的恐惧。

2. 全球耐药监测项目


认识到耐药性的严重影响和对可靠数据的需求,世界卫生组织和国际抗结核及肺病联盟于1994年启动了全球药物监测项目,目的是监控及评估问题的严重性。在接受持续监测的国家中,只有4%的结核病突发事件发生,定期调查是收集数据的主要手段。有关系统采样和要使用的实验室方法的指南已经发布。已开展了一项实验室强化计划,并建立了一个由国家和超国家推荐实验室组成的全球网络,以提供质量保证的测试。最初的耐药性调查是针对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素,最近也收集了对主要二线药物(氟喹诺酮和二线注射类)的耐药性数据。数据来源于160个国家/地区,覆盖了世界97%的人口和结核病病例。持续的监测和重复调查已使一些国家的趋势得以监控。

评估结核分枝杆菌药敏性的表型测试在技术上具有挑战性,部分原因是疏水性细菌的生长速度缓慢以及它们在培养过程中容易结块,吡嗪酰胺的易感性尤其难以评估,因此,它不能参与全球监视项目的调查。世卫组织于2018年发布了经修订的二线药物敏感性测试指南,包括对新药物贝达喹啉和德拉马尼的推荐临界浓度。对于一些较少使用的药物,例如对氨基水杨酸、亚胺培南、美洛培南、阿莫西林和克拉维酸,尚未就所使用的临界浓度达成共识。处理结核病菌培养时,需要严格的微生物安全预防措施,而在疾病最普遍的资源贫乏的地区,所需的实验室基础设施很少。样品在长距离和困难地形上运输到转诊实验室可能会遇到问题,地区间质量保证实验室进行培养的分离菌株再检测的费用非常昂贵。耐药性调查需要大量资源,因此在资源稀缺的国家中并不经常进行。在2002年至2017年的15年中,进行了用于评估2017年WHO结核病报告中公布的耐药水平的调查。2014年或更晚时期完成的最新调查被用来估算全球结核病病例占43%的国家的耐药性。由于缺乏数据或数据来自2002年前,占全球结核病发病率的5%的另外59个国家和地区的值来自于建模估算。印度的耐多药结核病病例最多,估计为147,000例,其次是俄罗斯联邦,为63,000例。吉尔吉斯斯坦的耐多药结核病发病率最高,每10万人中有80例,其中分别有27%和60%的新发结核病和先前治疗过的结核病是耐多药结核病。

3. 耐药机制


结核分枝杆菌复合群包含一组感染人类和其他哺乳动物的密切相关的细菌。主要的人类病原体结核分枝杆菌(MTB)具有4.4Mb的单个环状基因组,具有异常低的突变率,并且没有质粒携带的基因转移或株间重组的迹象。已经确定的有七个谱系,其中一些具有离散的地理起源。MTB中的耐药性是由单核苷酸多态性(SNP)、插入和缺失(indels)以及编码药物靶标或转化酶的基因偶尔缺失引起的。人们认为外排泵调节的改变在耐药性的产生中起作用,并且对于某些药物的补偿机制已被描述为在耐药性获得过程中产生对抗性适应性降低。表2列出了与抗结核药物耐药相关的作用方式和基因座。在已知药物靶标的晶体结构的情况下,可以对突变的影响进行建模,以预测蛋白质稳定性和药物结合的变化。利福平与细菌RNA聚合酶的β亚基结合后,引起耐药性的突变得到了很好的表征,但许多其他药物仍存在不确定性。通过对敏感和抗性菌株的集合进行序列分析后的统计推断,已经确定推定的抗性基因座。最近,全基因组关联研究(GWAS)已将清单扩大到包括尚未完全了解其作用方式的药物。类似地,可以使用基于树的“ PhyC”测试来检测抗性突变,以进行收敛进化以鉴定同系变体。多态性引起的抗药性的可靠性随可用数据量的增加而增加,但是对于许多突变,缺乏实验证实。最近已经开发出用于解释突变与表型药物抗性之间关联的标准化方法,由此将突变归类为具有高、中、最小或不确定的预测抗性置信度或与抗性无关。对已发表数据的与利福平、异烟肼、氧氟沙星/左氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、链霉素、乙硫异烟胺/丙硫异烟胺和吡嗪酰胺抗药性相关的突变进行评估,鉴定出286个突变,具有高、中、最小的置信度来预测耐药性。在一项新的进展中,最近的研究已经在基因座处鉴定出了可预测耐药性出现的突变,这些突变可用于鉴定具有耐药性结核病高风险的患者。

表2 与抗结核药物耐药相关的作用机制和基因座

药物 作用机理 抗性基因
Isoniazid 抑制细胞壁合成 katG, inhA-mabA, furA, mshA, ahpC promoter
Rifampicin 抑制RNA合成 rpoB
Ethambutol 抑制细胞壁合成 embA, embA promoter, embB
Pyrazinamide 投机性:抑制脂肪酸合酶或膜运输 pncA
Levofloxacin 抑制DNA促旋酶 gyrA, gyrB
Moxifloxacin 抑制DNA促旋酶 gyrA, gyrB
Gatifloxacin 抑制DNA促旋酶 gyrA, gyrB
Amikacin 抑制蛋白质合成 rrs
Capreomycin 抑制蛋白质合成 rrs, tlyA
Kanamycin 抑制蛋白质合成 rrs, rpsL, tap, eis romoter
Streptomycin 抑制蛋白质合成 rrs, rpsL, gidB, mshA, inhA-mabA, fabG-1 promoter, whiB7
Ethionamide or prothionamide 抑制细胞壁合成 ethA, ethR
Cycloserine or terizidone 抑制细胞壁合成 Alr, ald
Linezolid 抑制蛋白质合成 rrl, rplC
Clofazimine 与分枝杆菌DNA结合 mmpR
Bedaquiline 抑制ATP合成 atpE, mmpR
Delamanid 抑制霉菌酸的合成 fbiA-C, fgd1, ddn
p-aminosalicylic acid 抑制DNA前体的合成 thyA, thyX-hsdS.1
Imipenem and cilastatin 抑制细胞壁合成
Meropenem 抑制肽聚糖合成 Rv2421c-Rv2422 intergenic region
Amoxicillin and clavulanate 抑制细胞壁合成/β-内酰胺酶
Thioacetazone 抑制霉菌酸的合成 hadABC, mmaA4

4. 下一代测序(NGS)


由于需检测基因的数量、复杂性和分布,MTB耐药的分析具有挑战性。传统的分子技术没有足够的能力来评估完整的抗药性突变,因此需要进行多次分析。相比之下,在单个实验中,全基因组测序(WGS)有可能得到所有基因信息,检测所有类型的突变,并且可以区分引起抗性的突变和不改变表型的沉默突变。例如,Xpert MTB/Rif无法识别所有突变,导致美国食品和药物管理局建议也必须同时进行表型DST。如果对利福平的耐药分子检测不能识别rpoB基因的沉默突变,它们也容易产生假阳性。NGS的另一个优点是序列数据可以存储,并在发现新的抗性基因时重新访问。表3概述了NGS提供的用于监测耐药性的其他好处。最重要的是减少对高传染性抗药性MTB细菌的处理,并有可能降低监测计划的成本而实时MTB的运输成本却令人望而却步。高通量测序仪一次可以检测多个样本,因此专家研究实验室是可以引入并负担得起的。用于健康管理的NGS在基因筛查和抗癌药物相关检测的带动下取得了领先地位,但也越来越多地应用于病毒和细菌病原体的检测。台式测序仪现已入驻于病理实验室中,商业实验室以有竞争力的价格提供快速周转时间的检测。用于抗性分析的最流行的NGS方法是产生多个短片段(reads)的方法,这些短片段与参考基因组(例如H37Rv)比对或通过计算组装在一起并与参考基因组进行比较。覆盖特定核苷酸的序列数(覆盖深度)表明序列数据的质量,因为序列数越多,就越能得到可信的序列。在分析MTB的耐药突变时,关于所需的reads数目尚无共识,但通常会排除覆盖范围小于十个reads的区域。当样品中含有一种以上的MTB菌株(混合感染),或者同一样品中存在耐药菌和易感细菌(异质性耐药)时,可能需要增加覆盖深度。在对耐药性临床分离株的异质性耐药的研究中,Operario等人要求覆盖至少100个reads。他们发现20/35(57%)的菌株在至少一个基因座中具有异质性耐药的证据,他们定义为至少1%的差异reads。其他研究使用深度测序,并且对患者分离株进行了纵向研究,Trauner等人将其测序平均深度达到了1000倍。据报道,异质性耐药的发生率在基因座上有所不同,据报道与氟喹诺酮耐药性有关的基因座水平更高。

表3 NGS在监测抗结核药物耐药性方面的优势

潜在优势 意义
减少MTB活菌培养的过程 降低实验室人员的微生物安全风险

实验室成本最小化

减少将MTB活菌运输到区域参考实验室 降低质量控制成本
缩短取得结果的时间 加速获得监测数据
扩大了调查药物的数量 以最小的实验室成本扩展监控药物范围
存储的基因组数据 当发现新的耐药位点或预测对类似药物的交叉耐药性时,可以重新检查。
基因组数据可用于识别具有MDR或XDR-TB风险较高的传播热点或区域 指导减少耐药结核病传播的公共卫生干预
减少测试方法的差异 增强数据可信度
减少对不确定的关键药物浓度的依赖 增强数据可信度
关于MTB谱系/基因型的数据 更好地了解MTB流行病学
与NGS诊断方法在其他传染病方面的操作协同作用 综合设施和培训可以降低成本,就报告术语达成共识将有助于卫生从业人员利用NGS方法
资料储存库 基因组和相关的表型数据可以为研究界提供宝贵的资源
加速反馈耐药谱的机会 加速获得治疗耐药疾病的潜力

NGS已用于众多结核病研究中,研究了超过10,000个MTB基因组序列的传播动态,爆发和耐药模式的探索。Illumina测序仪(Illumina,美国)和Ion Torrent或Ion Semiconductor测序仪(Ion Torrent Inc.,美国,Thermo Fisher Scientific)这两种平台已成功用于分析耐药MTB。在英国、美国和意大利进行的研究表明,与传统方法相比,NGS在分枝杆菌鉴定和耐药性检测方面可能更快、更具成本效益。但是,测序需要一定量的MTB DNA而在临床标本中是很少的,所以需要进行分离和培养才能产生WGS所需的足够模板,此过程可能需要数周的时间。直接从痰液样本进行测序的工作正在进行中,并且已经在理论上获得了证明。使用样品富集方法(其中使用生物素化的RNA诱饵选择性捕获MTB DNA)使能够对所有20个涂片阳性痰标本和一个涂片阴性标本进行WGS。在英国(UK),该方法已被用于指导抗药性结核的治疗;但是,所需试剂的高昂成本可能会限制其在结核病流行的资源有限的地区中的应用。在英国进行的另一项研究中,发现一种更快、更便宜的提取程序可产生足以预测48小时内测试的40个痰液样本中的24个耐药性的基因组序列数据。既可以负担得起又足够强大的方法正不断努力改进和开发以用于监测研究。新的测序技术还正在开发,这些技术有望带来更快的结果和更低的运行成本,并且其中一些技术具有从较少的DNA量进行测序的潜力。一项可行性研究表明,便携式测序设备MinION测序仪(Oxford Nanopore Technologies,英国牛津)能够对MTB进行测序,以提供有关耐药性的信息

4.1. 分析工具

NGS会生成大量数据,并且需要复杂的计算流程来处理原始数据。已经有一些为MTB开发的简化工具,可大大减少对生物信息学专业知识的需求,并且有几种算法可提供细菌的谱系/基因型及其耐药性。表4汇总了已发布的非商业工具。这些工具的速度和易用性取决于所采用的方法。通过参考与抗性相关的基因座的选定文库来鉴定抗性突变,分析工具的敏感性和特异性取决于所选知识库的范围和质量。对于几种药物,耐药位点的知识不完整,没有一个公开的知识库提供抗结核药物的完整列表。需要指出的是,许多研究都集中在SNP的检测上,而对插入缺失和大片段缺失的关注较少。但是,最近的GWAS表明,插入和缺失对于检测卷曲霉素、环丝氨酸、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸和吡嗪酰胺的耐药性很重要。为了加快识别完整的MTB耐药谱的进展,在Bill&Melinda Gates基金会(BMGF)、Critical Path Institute(C-Path)、创新诊断基金会(FIND)、世界卫生组织(WHO)、美国疾病控制与预防中心(CDC)、新诊断工作组(NDWG)和国家过敏与传染病研究所(NIAID)的参与下制定了一项协作计划 。国际研究小组为建立结核病测序数据平台(ReSeqTB)做出了贡献,该平台对MTB基因型、表型和相关元数据进行了归总。https://platform.reseqtb.org/对所有人开放参与数据收集,但要遵守质量和道德标准。该计划旨在提供一个可供研究界使用的动态全球数据存储库,以及一个标准化且经过验证的分析工具。

表4 用于分析MTB全基因组数据以检测耐药性的非商业工具

工具名称 工具地址 涉及的药物 包括的基因 谱系分析
TB Profiler http://tbdr.lshtm.ac.uk/ Amikacin, bedaquiline,

capreomycin, clofazimine,

ethambutol, ethionamide,

isoniazid, kanamycin,

linezolid, moxifloxacin,

ofloxacin, pyrazinamide,

p-aminosalicylic acid,

rifampicin, streptomycin

ahpC, aphC promoter,

ald, alr, eis promoter,

embA, embA promoter,

embB, embC, embR,

ethA, ethA promoter,

ethR, folC, gyrA, gyrB,

gid, inhA, katG, kasA,

inhA promoter, panD,

katG promoter, pncA,

pncA promoter, ribD,

rplC, rpoB, rpoC,

rpsA, rpsL, rrl, rrs,

Rv0678, tlyA, thyA,

thyX promoter

Yes
Mykrobe

predictor

http://www.mykrobe.com/

products/predictor/

Amikacin, capreomycin,

clofazimine, ethionamide,

isoniazid, kanamycin,

moxifloxacin, ofloxacin,

pyrazinamide, rifampicin,

streptomycin

embB, eis, fabG1,

gyrA, katG, rpsL,

rpoB, rrs

“种”水平
PhyResSE https://bioinf.fzborstel.de/

mchips/phyresse/

Ethambutol, isoniazid,

pyrazinamide, rifampicin,

streptomycin

ahpC, embA, embB,

embC, gidB, katG,

inhA, ndh, pncA,

rpoB, rpsL, rrs

Yes
CASTB http://castb.ri.ncgm.go.jp/

CASTB/

Ciprofloxacin, ethambutol,

isoniazid, pyrazinamide,

rifampicin, streptomycin

embB, katG, inhA,

pncA, rpoB

Yes
KvarQ https://github.com/kvarq/

kvarq/releases

Ethambutol, isoniazid,

pyrazinamide, rifampicin,

fluoroquinolones

(not differentiated)

embB, katG, gyrA,

inhA, pncA, rpoB,

rpsL

Yes

4.2 质量和准确性

NGS检测MTB耐药性的可靠性和准确性在临床表现的前瞻性研究中尚未完全确定。商业短读长测序平台符合国际质量标准,并已在包括美国食品和药物管理局在内的许多辖区获得了其诊断用途的监管批准。使用耐药MTB的临床分离物进行的一项小型研究支持了其固有的可靠性,该研究也表明,差异性更可能是由于样品质量或所用分析工具的不一致而引起的。众所周知,MTB的DNA难以提取,如果DNA受到破坏或污染(包括人类或其他生物体中过量的DNA的存在),测序文库的制备可能会受到不利影响。分析的敏感性和特异性取决于所用抗性突变参考库的准确性和包容性。如果分析算法仅对SNP进行测试,而不包括插入缺失和大缺失,则灵敏度也会降低。可以通过将NGS结果与表型药物敏感性测试数据进行比较来进行分析工具的验证。对表型测试结果的信心不高本身就具有挑战性,并且有人主张基因型证据是判断新技术的更可靠参考标准。可以预期,NGS将比当前的分子检测(如检测有限个基因座的Line Probe Assays)更加灵敏。结核病传播的克隆性质导致菌株在地理上聚集并局部富集特定突变。使用来自六个国家的792个分离株的序列和表型数据对“TBProfiler”耐药性和谱系分析工具进行了验证,发现预测耐药性的敏感性和特异性随样品的地理来源而有所不同。暴发调查和传播链研究导致测序了几乎相同的MTB菌株的大集合,如果用于验证研究,这些集合可能会产生偏差。重要的是,选择用于验证研究并评估突变的敏感性和特异性以预测耐药性的样品应代表全部的耐药菌株。

关于NGS检测耐药性的前瞻性研究数据较少。一项多国的研究比较了7094名患者的测序数据(全基因组或Sanger测序)与表型DST。用于检测对利福平、异烟肼、氧氟沙星、莫西沙星、吡嗪酰胺、卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素耐药性的测序灵敏度分别为91%(95%CI:87-94),86%(95%CI:74-93),85%(95%CI:77-91),88%(95%CI:81- 92),54%(95%CI:39-68),79%(95%CI:58-90),90%(95%CI:82-95),81%(95%CI:56-93)。在英国,对777个MTB分离株进行的前瞻性研究将Illumina WGS与四种一线药物的表型敏感性测试进行了比较,发现失败率高达11.9%,认为是获得的序列数据量不足导致的。另外5.2%的耐药预测不确定,原因是存在分析所用知识库中未包含的新的或以前未表征的突变。除去这些失败的,基因组测序预测异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺耐药的敏感性分别为93.1%(95%CI:84.5-97.7),100%(95%:87.7-100),100%(95%CI:66.0-100)和81.8%(95%CI:48.2-97.7)。特异性一直很高,所有药物的特异性都超过98.5%。纽约的一项较小规模的研究(n=119-357)报道,对利福平、卡那霉素和氟喹诺酮类药物的表型耐药性敏感性为100%,对异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素和乙硫异烟胺的敏感性分别为87%,79%、86%、73%和62%。所有药物的特异性均超过97%。印度对从泰米尔纳德邦(Tamil Nadu)的196名随机选择的患者中分离出的菌株进行的研究表明,其对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的耐药性检测敏感性较低,分别为76.5%、72.7%、60%和80%。但是,这些样本中几乎没有耐药的样本,作者建议进一步研究以探索该种群中耐药突变的模式。

NGS的潜在敏感性和特异性的估计也采用了计算机模拟分析,其中利用了来自不同地理来源的数据。如预期的那样,利福平抗性的预期准确性很高,敏感性和特异性的估计分别超过90%和95%。其余药物的特异性都超过90%,但预测耐药性的能力较低。据报道,除了吡嗪酰胺,对其他一线药物和氟喹诺酮类药物预测的敏感性在80%至90%之间。对于其余药物,敏感性的估计值随着用于分析的耐药知识库而变化。据报道,吡嗪酰胺的敏感性估计值为50%-62%,而二线注射类(SLIDs)的敏感性为67%-90%。关于其他药物的数据很少,环丝氨酸和对氨基水杨酸(PAS)的报道预测值分别为61%和65%。二线药物和较少使用的药物的表型敏感性数据缺乏是一个限制因素,需要进一步的研究。但是,要充分了解NGS检测耐药性的能力,需要进行大型的多中心前瞻性研究,以比较将NGS数据与表型和使用替代方法获得的确证基因型数据进行比较。

5.  实施NGS进行结核病监测


NGS耐药诊断正在迅速受到人们的欢迎,这是为耐药结核病患者提供个性化治疗药物的一种手段,但是在将其用于监测计划之前,仍有许多技术问题需要解决。表5列出了一些挑战和可能的对策。首先,需要简化和优化样品制备方法,以便直接从痰液开始测序。缺乏进行表型药物敏感性测试的能力以及所涉及的费用一直是全球监测活动的主要障碍,而不再需要分离、培养和运输活的MTB将提供巨大的优势。必须提供价格合理的DNA提取试剂盒,最好提供自动化选项,以减少操作员的错误并提高一致性。同样重要的是记录和测序报告的术语标准化。结核病专家的国际社会必须理解所使用的语言。结核病专家的国际社会必须理解所使用的语言。各种学术研究小组尚未就使用的最佳生物信息学工具达成共识,建议略有不同的策略(摘要请参见表4)。需要进行独立研究,以比较使用不同地理区域的样本的分析工具。除了采用通用的标准化方法进行NGS分析外,还需要建立外部质量保证体系,类似于已经为表型测试建立的体系。

表5 NGS在监测抗结核药物耐药性方面所面临的挑战

挑战 应对
可直接从痰液进行全基因组测序的样品处理方法 通过培训实验室人员来提高结核病流行国家的技能
发展通用术语 由专家委员会审议
在数据分析和解释上达成共识 在计算机分析中确定和比较可用的生物信息学工具对于每种抗结核药物的性能。由专家委员会审议
统一的样品提取、测序和分析方法 由专家委员会审议
缺乏MTB特定的质量标准 召集专家委员会,酌情采用现有标准
建立经认可的测序实验室网络,按照约定的实践开展工作,包括生物信息学能力 在现有网络的基础上建立区域型方法。
序列衍生数据与现有监测数据的集成 世卫组织和专家委员会制定准则。

由国家结核病控制规划实施。

为实施和确保可持续性筹集资金 准备具有成本效益分析的业务计划和模型以预测未来的节省开支

结核不是第一种利用测序进行监测的疾病。在HIV领域已经确立了先例,使用基因分型来评估对抗逆转录病毒药物的耐药性。斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库于2007年建立,用作基因型、表型和临床数据的公共存储库,从而促进了术语和数据解释共识指南的发展。世卫组织关于艾滋病毒耐药性监测的准则于2015年更新,并建立了全球检测中心和基因分型实验室网络。还利用NGS进行监视的其他领域包括流感、脊髓灰质炎和疟疾以及一些食源性疾病。

将NGS用于诊断用途正在促使人们考虑质量和安全性问题,但是尚未报导国家监管机构批准NGS用于诊断结核病耐药性。对于监测,管理不是必需的,但是可以预期,世卫组织将与会员国协商制定标准。据报道,由四个欧洲机构组成的联盟正在考虑适用于欧洲实验室的TB NGS标准

6. 专家评论


使用全基因组测序进行结核病耐药性的全球监测具有相当大的优势,但是在实施此类计划之前,还需要解决一些问题。尽管NGS很容易被人们接受作为研究工具,但NGS的概念对于许多在结核病控制领域处于前沿地位的研究人员来说是陌生的,并且需要一段过渡期来为参考实验室做好准备,以改变其作用。同样,目前需要为大多数低收入国家的结核病控制活动提供资金捐助的群体必须确信测序方法的后勤和成本效益。需要指出的是,在国内发展分子生物学和生物信息学的能力可能需要几年的时间,特别是对于那些结核病控制计划尚未参与该领域合作研究活动的国家。缺乏与结核病流行国家有关的费用数据。试剂和资本成本可能会高于欧洲或美国,但将测序外包给高通量测序中心将大大减少所需的财务支出。有趣的是,已经在南亚和东南亚的两个国家/地区建立了高通量测序中心,这两个地区的结核病患病率都很高。但是,非洲的测序能力仍然相对较低,它仍然是国际资助的研究中心的区域。

技术和后勤方面的挑战仍然很大,尤其是标准化样品制备方法的发展。为了确保监测数据的可靠性,将需要有适当标准的质量保证程序。当前的迹象表明,基因组测序提供了对主要的一线抗结核药物和氟喹诺酮类药物耐药性的可靠测量方法,但是还需要进一步的研究来确定NGS预测其他二线药物和不常用药物耐药性的准确性。解密MTB耐药机制是一项受临床需求驱动的工作,在发现和验证新的耐药标记时,需要灵活的数据管理程序来适应新的耐药标记。以前的监测活动仅限于一线药物,不包括吡嗪酰胺,而全基因组方法将极大地丰富可用的数据

基于基因组的全球监测计划提供的另一个好处是,可以为本地和国际研究组织创建一个具有高价值的丰富数据库。抗生素耐药性的出现是全球性的紧急情况,应将MTB WGS数据视为全球公共健康品,应广泛为所有人可得,使用这些数据所产生的惠益应公平分享。我们应该努力就数据共享达成共识,以确保充分利用和使用数据,并确保产生和拥有数据的国家从中受益。

7. 五年展望


下一代测序技术和抗结核药物耐药分子机制的知识正在飞速进步。预计在五年内,工业化和大多数中等收入国家将采用测序方法来监测结核病耐药性。低收入国家(其中许多结核病负担高)将按照世界卫生组织与国家结核病控制规划磋商后发布的指导方针,开始在其结核病监测活动中实施测序。

参考文献:Mcnerney R , Zignol M , Clark T G . Use of whole genome sequencing in surveillance of drug resistant tuberculosis[J]. Expert Review of Anti-infective Therapy, 2018, 16(5).

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