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基因组学结核病诊断:机遇和挑战(上)

耐药结核分枝杆菌(MTB)是对全球结核病控制的威胁。全面、及时的药物敏感性检测对于耐药结核病患者的恰当治疗至关重要。表型药敏检测是结核分枝杆菌耐药判断的金标准。结核分枝杆菌全基因组测序技术(MTB-WGS)可在一次实验中完成药敏检测和流行病学调查。

本文讨论了MTB-WGS在了解结核病分子流行病学和耐药机制方面所带来的巨大机遇。也讨论了结核病药敏检测在患者管理方面的临床价值以及实时的干预控制对公共卫生的影响。MTB-WGS已经在低负担高收入地区(例如英国)常规开展,以便为患者治疗和公共卫生干预提供重要的信息。我们认为利用MTB-WGS在高负担地区中进行常规检测对结核病的控制效果将更为显著。

==   简介  ==

为了遏制结核病耐药性的增加以及结核病的传播,全面的药敏检测对耐药患者的及早发现和有效治疗至关重要。监测和了解结核病耐药的发展、演化和流行情况也很重要,以便为公共卫生干预提供重要信息。

分子检测技术如Xpert MTB/RIF(Cepheid,USA)和线性探针GenoType MTBDRplus/sl(Hain lifescience,Germany)等极大缩减了药敏检测的时间,同时也缩短了诊断周期,但是这些方法只能少数药物的敏感性结果。

对于结核病高负担并且常规药敏检测能力不足的地区,MTB-WGS是一种有效的方法,可用于结核病治疗决策所需的药敏检测,也有助于结核病的耐药监测。同时,测序数据也有利于流行病学的调查,例如结核病传播链的分析。

本文回顾MTB-WGS如何影响结核病耐药的检测,进而影响结核病的治疗管理,尤其是在高负担地区的影响。我们重点总结了MTB-WGS数据如何常规地为患者治疗、传播分析、公共卫生干预及连续耐药监测提供指导。我们还分析了MTB-WGS在临床开展常规应用的挑战,尤其是在资源有限的结核病高负担地区。

==  MTB-WGS的机遇  ==

+ MTB-WGS结核病控制中的应用

新一代测序技术(NGS)使全基因组测序成为分子流行病学研究的一种更快、更实惠、更易获得的替代方案。从全基因组测序产生的数据对检测结核分枝杆菌遗传变异具有无与伦比的能力。对结核分枝杆菌全基因组测序数据的系统发育的重构,增加了我们对结核分枝杆菌全球分布的认识。

全基因组测序技术已被用于解答结核分枝杆菌传播的问题,并且在不久后将成为结核分枝杆菌分型的常规方法,因为它具有远高于传统分型方法的分辨率。研究表明,可以通过比较结核分枝杆菌基因组间的单核苷酸多态性(SNPs)来判断菌株间的相关性。具有最小数量的SNPs或最短遗传距离的分离株将被关联起来,可能代表直接传播或暴发事件。普遍采用5个或更少的SNPs来判断直接传播事件;研究建议最多三个SNPs代表人传人的事件。Walker等(2012)研究了英国具有流行病学相关的分离株之间的SNPs数量,发现都在5个SNPs以内的差异,因此得出了5个SNP阈值的结论。

基于流行病学背景调查的方法得到潜在的直接传播事件,此时全基因组SNPs数量不超过5个,但这种分析策略的缺点是它依赖于流行病学背景数据,而在多数结核病高负担地区中通常无法获得流行病学关系。另一种策略是分析不太可能有直接传播关系的菌株之间SNPs,由于不具有直接传播关系的菌株间SNPs数量会超过2个,所以有研究使用0-1个SNP来判断直接传播关系。在传播时间估算的研究中,有使用SNPs突变率来作为阈值。这种方法假设突变率是随时间变化线性相关的,但情况并非总是如此。有研究使用每天0.003个SNP的突变率来并且≤10个SNPs的阈值作为直接传播的判断。

对全基因组数据的分析,例如SNP的聚类,使我们能够深入了解结核分枝杆菌暴发期间的传播动态以及患者间的相关性。

MTB-WGS结合社会网络分析鉴别出社会环境因素成为加拿大哥伦比亚疫情暴发的驱动因素。通过对旧金山另一次暴发的MTB-WGS分析,将没有明显流行病学联系的病例联系到的一起,并确定了微观进化事件,这些事件有助于确定可能的传播链。全基因组测序的分辨率优于分枝杆菌MIRU-VNTR,即使在没有流行病学背景数据的情况下,MTB-WGS也可以使用SNPs推断病例之间的传播关系。这一点至关重要,因为结核病暴发经常发生在难以收集流行病学背景数据的地区。MTB-WGS的卓越分辨率使我们能够区分复发和再感染,对于准确评估治疗和预防计划至关重要。WGS已被用于了解高负担地区中的传播规律,证明该方法在确定高负荷地区中的结核分枝杆菌传播规律方面确实具有重要的影响。

++ MTB-WGS鉴定混合感染

结核病混合感染的定义是:由不少于2种不同亚型的结核分枝杆菌感染引起的结核病。传统使用MIRU-VNTR结果来判断的,然而使用MTB-WGS分析杂合碱基可以提供更优的混合感染分辨率。不同的研究工作使用MTB-WGS杂合碱基分析来判断混合感染的方法不尽相同,比如有些研究认为超过80到140个杂合碱基的样本是混合感染,也有研究认为如果超过38%的reads支持碱基的杂合性则判断为混合感染。混合感染在结核病高负担地区中更常见,约有10%至20%的比例。

与新发病例相比,复治病例的混合感染率更高。它们也与一些不利因素有关,特别是那些具有不同的药敏谱的混合感染或者由HIV引起的潜在免疫抑制的情况下。混合感染会对诊断结果产生影响,Xpert检测对混合感染的利福平耐药率敏感度较低(80%),而非混合感染则为93%。鉴定混合感染对于评估结核病治疗的有效性也至关重要。分离株耐药性的变化有时是因为混合感染了不同药敏谱的结核分枝杆菌。不同药敏谱的混合感染病例易被误判为接受抗结核治疗后的获得性耐药,最终会误导治疗干预

+++ MTB-WGS的药敏检测

与那些针对特定耐药基因检测的分子方法不同,MTB-WGS在全基因组水平检测结核分枝杆菌的耐药突变,同时还可以发现新的耐药基因或新的突变。MTB-WGS可以检测出补偿耐药突变,具有这种补偿耐药突变的菌株尽管不是与耐药直接相关,但也会导致菌株的耐药。通过MTB-WGS分析泛耐药结核病(XDR-TB)暴发菌株的突变,我们知道并非所有暴发事件都是由耐药菌株引起的,因为在许多分离株中发现耐药突变是相对独立获得的。

虽然很多都是回顾性地研究,但也可以看到MTB-WGS检测药敏与表型DST显示出很好的一致性,并且周期更短(尤其从早期培养阳性开始)。在一项回顾性研究中,发现基于MTB-WGS检测的耐药结核病(MDR-TB和XDR-TB)治疗方案与表型DST的治疗方案一致性极高。基于MTB-WGS的治疗方案不包含任何表型显示耐药的药物,并且MTB-WGS可检测更多的药物,比如乙胺丁醇,所以利用MTB-WGS能排除现有治疗方案中可能表型耐药的药物。通过对治疗方案的影响,MTB-WGS可以使治疗方案更加合理,并且还可以减少不必要的药物毒性

有充分证据表明MTB-WGS在恰当治疗方案的选择方面优于Xpert和线性探针法。有些现象,比如MTB-WGS显示低水平耐药,但表型DST显示敏感,这可能是因为表型DST设定的临界浓度过高;或者表型DST显示敏感,但MTB-WGS鉴定出新的或不确定耐药相关性的突变。这说明结核分枝杆菌耐药-表型相关的机制还需更多的研究。MTB-WGS用于物种鉴定和一线药物的敏感性检测时间,与线性探针的物种鉴定及表型DST药敏的整体检测时间相比,二者检测时间是相当的。当MTB-WGS初始被引入结核病检测流程时,检测的周转时间与表型DST相当。当MTB-WGS成熟运用后,MTB-WGS的结果比表型DST提前了9天。由于耐药相关的基因型-表型的知识不足,MTB-WGS技术还有技术改进的空间。如果能成功将MTB-WGS应用于临床样本(如痰液而不需要培养)的直接检测,那么MTB-WGS结果的周转时间可能会进一步降低。

++++ MTB-WGS用于连续耐药监测

为了衡量全球结核病耐药控制策略的有效性,关于结核分枝杆菌药敏的准确数据至关重要。世卫组织建议对所有结核病患者进行DST,以持续监测耐药性。然而,大多数高负担国家仍然依赖于每五年一次的流行病学调查。这是因为对所有结核病患者开展常规DST的能力严重缺乏。在多数情况下,分子方法如Xpert MTB/RIF是疑似MDR-TB病例检测的可用方法。还有一些国家有条件只进行一线药物DST,但必须将二线DST的样品送到国外的实验室。利用MTB-WGS对所有结核病患者进行常规耐药监测是一个有吸引力的策略。然而,大多数高负担国家甚至难以向可疑的结核病耐药病例提供表型检测。

使用MTB-WGS对所有结核病患者常规开展表型检测在短期内似乎成本效益较差。然而,在高负担地区中常规开展MTB-WGS的影响和成本效益尚待研究,以确定MTB-WGS在这种情况下的可行性。MTB-WGS可得到一线药物和二线药物的敏感性检测结果,这些数据可以成为掌握结核病流行病学的宝贵数据。MTB-WGS已成功用于乌干达的结核病耐药调查的数据补充,对其中异烟肼和利福平耐药的菌株使用MTB-WGS以更深入地了解耐药程度。

文献:Iketleng T, Lessells R, Dlamini M T, Mogashoa T, Mupfumi L, Moyo S, Gaseitsiwe S, de Oliveira T. Mycobacterium tuberculosis Next-Generation Whole Genome Sequencing: Opportunities and Challenges[J]. Tuberc Res Treat, 2018, 2018:1298542.

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